Протоколы окраски по Папаниколау I.

Подготовка к публикации, перевод и комментарии А.В. Безрукова.

 

1. Первый вариант протокола окраски по Г. Папаниколау (1942-1943 г.г.) [1,2].

PAP-42-43-1

Рис.1. Копия страницы 1 репринта статьи [1] (между страницами 6 и 7 книги [2])

PAP-42-43-2

Рис.2. Копия страницы 2 репринта статьи [1] (между страницами 6 и 7 книги [2])

 

2. «Меморандум по окраске» - вариант методики, опубликованный в [3]

PAP-memorandum on staining - 1

Рис.3. Копия первой страницы вставки (между страницами 12 и 13) книги [3]

PAP-memorandum on staining - 2

Рис.4. Копия второй страницы вставки (между страницами 12 и 13) книги [3]

 

3. Перевод (приведён перевод только протоколов окраски).

 

Таблица 1

1942-1943 1960-1963

 

Процедура окраски заключается в следующем:

1. Фиксируйте мазки немедленно (до их высыхания) в равных частях 95 % алкоголя и эфира в течение от 5 до 15 минут. Ополосните в 70 % и в 50 % спиртах и в дистиллированной воде.

2. Окрашивайте в гематоксилине от 5 до 10 минут. Ополосните в дистиллированной воде. Ополосните от 3 до 4 раз в 0,5 % водном растворе соляной кислоты. Тщательно промойте в воде. Оставьте на минуту в слабом растворе карбоната лития (3 капли насыщенного водного раствора на 100 см3 воды). Тщательно промойте в воде.

3. Ополосните в дистиллированной воде, затем в 50%, 70%, 80% и 95% спирте.

4. Окрашивайте до 1 минуты в растворе (OG 6), приведенном ниже.

5. Ополосните от 5 до 10 раз в каждом из двух сосудов, содержащих 95% спирт, для удаления избыточной краски.

6. Окрашивайте в ЕА 36 или в ЕА 25 до 2 минут.

7. Ополосните от 5 до 10 раз в каждом из трёх сосудов, содержащих 95% спирт. (Не используйте тот же спирт, который был использован после Оранжевого G). Ополосните в абсолютном спирте и ксилоле. Заключите в Clarite, Канадский бальзам, или Дамарлак.

 

 

II. Процедура окраски

1. После фиксации переместите слайды, не допуская высыхания, прямо в 80%-ный спирт и проведите через 70% и 50% спирты в дистиллированную воду.

2. Окрасьте гематоксилином по Гаррису точно в течение 3/4 минуты.

3. Промойте 3 раза в дистиллированной воде с использованием 3 отдельных ванн. Все ополаскивания должны быть очень нежными, для предотвращения смывания мазка со слайда.

4. Ополосните в 50%-ном спирте.

5. Поместите в раствор 1,5% гидроксида аммония в 70% спирте на одну минуту.

6. Ополосните в 70% спирте и проведите через 80% и 95% спирты.

7. Окрасьте в OG-6 в течение одной минуты с четвертью.

8. Промойте в 3 ваннах с 95% спиртом.

9. Окрасьте в EA-65 течение 3 минут.

10. Промойте 3 раза в 95%-ном спирте, используя 3 отдельных ванны.

11. Дегидратируйте и просветлите препарат, проведя его через: абсолютный спирт, смесь из равных частей абсолютного спирта и ксилола, ксилол.

Примечание: быстрое просветление может быть достигнуто путем вынимания штатива со стёклами из ксилола на доли секунды для стекания жидкости и повторного опускания в ксилол.

12. Заключите препарат при помощи Permount или другой подходящей монтажной среды.

 

4. Комментарии

1. Методика впервые опубликована в статье Георгиса Папаниколау [1]. Пропись повторена в 1943 году в монографии [2]. В приведенном выше протоколе применена регрессивная окраска в гематоксилине, причём Г. Папаниколау не указывает, какой гематоксилин используется.

2. Вариант методики «Memorandum on staining» (Меморандум по окрашиванию) опубликован на вкладке между 12 и 13 страницами в наиболее значимой монографии Папаниколау «Атлас эксфолиативной цитологии» [3]. В приведенном протоколе применена прогрессивная окраска в гематоксилине, действительно, Г. Папаниколау указывает, что используется гематоксилин по Гаррису с добавкой уксусной кислоты, время выдержки в гематоксилине – всего три четверти минуты, дифференцирование в кислоте не применяется.

3. Преимуществом окраски Г. Папаниколау считает прозрачность мазка, при сравнительно слабой окраске цитоплазмы, нет ущерба дифференциации различных клеток по цвету цитоплазмы и разрешению тонкой структуры ядер. Согласно [7] выравнивание окраски цитоплазмы (а соответственно, и возможность «дифференциации различных клеток по цвету») происходит за довольно длительное время – 6-10 мин, что значительно больше, чем в прописях Г. Папаниколау. Таким образом, Г. Папаниколау выбрал компромиссный вариант методики с высокой прозрачностью, но с недостаточным окрашиванием и выравниванием окраски цитоплазмы клеток.

4. В примечании (низ правого столбца Таблицы 1), Г. Папаниколау предлагает для ускорения процесса применить приём окунание, широко использующийся в методиках в настоящее время.

5. До использования приведенных здесь методик Папаниколау использовал окраску гематоксилин – эозин с докраской красителем Водный синий и окраску по Шорру [4-6] (модификация трихрома по Массону), с которым работал в Корнельском университете. Эти методики и явились основой для разработки окраски по Папаниколау.

6. В рецептуре красок, приведенных Г. Папаниколау, согласно [7], присутствуют ошибки:

- слишком большое содержание красителя в OG 6 приводит к выпадению осадка;

- в красках EA краситель Бисмарк Браун реагирует с фосфорно-вольфрамовой кислотой, что так же приводит к выпадению осадка. В большинстве современных красок рецептура скорректирована.

 

Литература

1.Papanicolaou GN. A new procedure for staining vaginal smears. Science. 1942;95:438–9.

2.Papanicolaou GN. Traut 1 IE. Diagnosis of uterine cancer by the vagina smear. Commonwealth Fund. New York. 1943.

3.Papanicolaou GN. Atlas of exfoliative cytology. Cambridge, MA: Published for The Commonwealth Fund by Harvard University Press;1963.

4.SHORR E. A NEW TECHNIC FOR STAINING VAGINAL SMEARS, SCIENCE VOL. 91, NO. 2361, MARCH 29, 1940, p. 321-322

5.SHORR E. A NEW TECHNIC FOR STAINING VAGINAL SMEARS II, SCIENCE VOL. 91, No. 2372 JUNE 14, 1940 p. 579-580

6.SHORR E. A NEW TECHNIC FOR STAINING VAGINAL SMEARS: III, A SINGLE DIFFERENTIAL STAIN, SCIENCE VOL. 94, No. 2449 DECEMBER 5, 1941 p. 545-546

7.Gill G. W. Cytopreparation Principles & Practice, стр. 150-151, Springer ISBN: 978-1461449324

Вся продукция зарегистрирована Минздравом России. Регистрационные удостоверения в разделе "Документы"